肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，HCC的发病机制复杂，涉及多种遗传和环境因素。HBV感染是其主要诱因，尤其在中国，HBV感染率较高，导致HCC的发病率和死亡率居高不下。近期研究指出，异常的糖缀合物水平与HBV相关的HCC（HBV-HCC）进展有密切联系，特别是糖缀合物在肿瘤发生、发展和转移中的作用。因此，理解HBV-HCC中糖缀合物的变化对于揭示其病理机制和发现新的诊断及治疗靶点具有重要意义。基于qULTRA多组学平台针对HBV-HCC进展中糖缀合物失调进行了蛋白质组学、糖组学和糖蛋白质组学，结合转录组学数据系统性研究，并验证了糖链作为诊断和预后生物标志物的可能性。
糖聚糖相关基因在HBV - HCC及癌旁组织中的表达：为了探究HBV-HCC 中糖基因表达和糖基化的差异，需要在HBV-HCC和相邻组织中鉴定出差异表达的糖基因，并进行了一系列的功能富集分析和蛋白质-蛋白质相互作用网络构建。作者使用了从GEO数据库获取的两个GSE基因表达谱数据集，包含7502和7839个HBV-HCC和邻近组织的基因差异表达。前100个差异表达的糖基因（DEGG）的PLS-DA显示HBV-HCC与邻近组织明显分离，功能富集分析揭示了糖基因主要涉及的分子功能类别包括碳水化合物结合、转移糖基和己糖基活性。聚类分析进一步显示，这些糖基因在蛋白质糖基化、GPI锚定生物合成过程以及糖基化过程中高度富集。在蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI）中，一些具有高度连通性的枢纽基因在特定糖基化过程中显著富集。实时定量PCR（RT-qPCR）分析HBV-HCC和邻近组织中的mRNA水平的结果显示，FUT家族成员在HBV-HCC组织中的表达存在显著差异。这些转录组学为理解HBV-HCC中糖基化失调尤其是关于岩藻糖基化提供了重要线索。
图1：GSE135631和GSE94660在HBV相关HCC中糖聚糖相关基因的差异表达。
A本研究的工作流程。B 已鉴定基因在GSE135631和GSE94660表达模式的火山图，突出显示了前100个差异表达的糖基因DEGG。C DEGG的偏最小二乘判别分析（PLS-DA）D 热图显示DEGG在HBV-HCC和邻近组织中的表达模式E DEGGs的功能富集分析F DEGG的PPI网络图 G RT-qPCR测定3对HBV-HCC及邻近组织中13个FUT、PIGV、PIGT、PIGM、B4GALT3基因的mRNA表达。
1.正常、肝炎、肝硬化和肝癌血清样本的N -聚糖谱
为了揭示异常的N-糖基化，HC（正常组）、CHB（肝炎组）、LC（肝硬化组）和HBV-HCC（肝癌组）血清样本中的N-聚糖通过MALDI-TOF/ TOF-MS分析，显示并注释了信噪比> 5的代表性N-聚糖的质谱图。结果显示共鉴定出36种不同的m/z N-聚糖结构，HC、CHB、LC和HBV-HCC样品中分别存在31、32、25和25种N-聚糖。值得注意的是，在所有被研究的组别中，均检测到了21种共有的N-聚糖结构，但这些结构的相对强度在不同组别中表现出了差异。
图2:HC、CHB、LC和HBV-HCC血清样品中N-聚糖的MALDI-TOF/ TOF-MS谱图。
2.正常、肝炎、肝硬化和肝癌血清样本的N-糖链分析：
qULTRA®糖组学平台鉴定的N-聚糖在HC、CHB、LC和HBV-HCC中表达模式的分层聚类结果表明，LC/HBV-HCC与HC和CHB有明显的分离，但LC/HBV-HCC不能相互分离。此外，定量比较分析显示，25、24和22个N-聚糖结构在CHB、LC和HBV-HCC中与HC有差异表达（图3A）。
HBV-HCC中的岩藻糖化N-糖链水平升高，高甘露糖N-聚糖的相对丰度降低(图3B)。与mRNA水平上FUTs表达升高一致，总聚焦化的相对丰度上调，其中单聚焦化水平升高，而双聚焦化水平降低(图3C)。其他末端修饰唾液化水平升高，随后HBV-HCC的进展减少(图3D)。与HC相比，CHB、LC和HBV-HCC中双天线结构的水平明显更高。而单天线结构逐渐减少(图3E)，结合转录组学和糖组学分析显示，在HBV-HCC的进展中，岩藻糖基化水平水平上调。
图3：HC、CHB、LC和HBV-HCC血清样本中的N-聚糖水平A N-聚糖在HC、CHB、LC和HBV-HCC中的表达模式和失调。B高甘露糖、复合和杂交N-聚糖的相对丰度。C双、单、a浓缩N-聚糖的相对丰度。D双、单、亚酰化N-聚糖的相对丰度。E单、双、三/四天线结构N-聚糖的相对丰度。
1.HBV - HCC血清样本中位点特异性糖蛋白组学分析：
qULTRA®糖蛋白质组学平台对HC、CHB、LC和HBV-HCC血清样本提供完整的糖蛋白组学分析，实现解码特异性N-糖基化，特别是岩藻糖基化在HBV-HCC进展中的生物学功能。结果显示，共鉴定出1114个糖肽，鉴定的糖肽代表129个糖位点，被102个聚糖结构修饰（图4A）。这些N-聚糖含有8个高甘露糖、13个杂交糖、77个复合糖和4个多甘露糖亚型（图4B）。定量比较分析显示，与CHB、LC和HCC相比，HC中分别有116、197和192个糖肽的差异表达，采用fold change > 1.5或< 0.67和p值< 0.05。来自73种糖蛋白的288种差异表达糖肽（DEGPeps）主要由复合型N-聚糖修饰（图4C），其中唾液酸化N-聚糖占比最大，其次是岩藻糖基化N-聚糖和双触角结构（图4D）。
图4：HC、CHB、LC及HBV-HCC血清糖蛋白定量分析A 从HC, CHB, LC和HBV-HCC样本中鉴定的完整糖肽的维恩图 B 从HC, CHB, LC和HBV-HCC样本中鉴定的完整糖肽的聚糖亚型分布 C 鉴定的糖肽的火山图表达模式。D 基于其附着糖基结构的差异表达完整糖肽的分类。
为了了解糖蛋白轨迹与HBV-HCC进展之间的关系，对所有DEGPeps进行了分层聚类，生成了四个聚类(I-IV)（图5A-B），来自“簇I”集群的差异表达糖肽的功能富集分析显示在内肽酶抑制剂活性、急性期反应、血液微粒、补体和凝血级联中富集。考虑到HBVHCC进展的恶性升级，筛选出49个“簇I”中具有聚焦化的糖肽，这些糖肽由23个岩藻糖基化的N-聚糖和来自21个蛋白的25个肽组成。鉴定出的21个糖蛋白中，含有1个糖位点的16个，含有2个糖位点的3个，含有3个糖位点的1个（图5C）。在这些糖肽中，IgA1-340-N5H5F1S2的PSM评分最高（图5D）。
图5：HC、CHB、LC和HBV-HCC中差异表达糖肽的分层聚类分析 A 不同表达的糖肽的模糊聚类B 簇I、II、III和IV糖肽的表达模式C 簇I中差异表达糖肽的功能富集分析 D 热图显示完整糖肽的PSM，包括不同的聚糖(下)和它们在不同糖蛋白中的糖位点位置(右)。
2.IgA1和IgG2的位点特异性岩藻糖基化：
基于糖蛋白组学数据，进一步绘制了IgA1和IgG2中DEGPeps的每个糖基上的N-聚糖结构。从IgA1和IgG2中共鉴定出30个和5个独特的完整糖肽，它们由3个糖位点(IgA1为144NLT和#340NVS, IgG2为#176NST)和31个聚糖组成(图6)。在这些糖肽中，岩藻糖基化占糖肽上所有聚糖的46%，并且大多数集中化的完整糖肽在HBV-HCC的进展中被上调。
图6:HC、CHB、LC和HBV-HCC中IGHA1和IGHG2的位点特异性聚糖谱。热图显示了IGHA1的Asn-144、Asn-340和IGHG2的Asn-176上所有已鉴定的聚糖。
3. ELISA验证：
在这些差异表达的糖肽中，来自IgA1和IgG2的7和3个位点特异性岩藻糖基化糖肽在HC-CHB-LC-HCC进程中显示出定向协同的上调。ELISA测定分别识别高甘露糖型N-聚糖、α1,6-岩藻糖和α1,2/α1,3/α1,4/α1,6-岩藻糖。结果显示，IgG2和IgA1的总水平没有显著变化，不同糖型在HBV-HCC的进展中表现出不同的表达模式。不同糖型在Igs上的不同表现表明，Igs上的糖基化在HBV-HCC的进展中发生了特异性改变（图7）。糖蛋白组学和ELISA分析的综合结果显示，IgA1和IgG2在HBV-HCC中高度岩藻糖基化，AAL反应性岩藻糖基化IgA1和IgG2上调，具有潜在的诊断价值。
图7：IGHA1和IGHG2完整糖肽的差异表达。
蛋白质组学分析
qULTRA®蛋白质组学平台对HC、CHB、LC和HBV-HCC血清样本提供蛋白组学分析，分别揭示了HC与CHB、LC和HCC中有78、163和186种差异表达蛋白（图8A）。在这些差异表达蛋白中，包括AFP在内的21种蛋白在肝脏疾病(CHB、LC、HBV-HCC)患者与HC相比，多种Igs表达上调(p<0.05) （图8B-C）。值得注意的是，与HC相比，肝脏疾病患者中IgA1没有表现出显著差异，而IgG2则显著上调（图8D）。其次，当IgA1在蛋白水平上保持不变时，IgA1[332 - 353]的岩藻糖基化位点占有率增加，导致IgA1[332–352]-N5H5F1S2或-N6H3F1S2升高，从而导致HBV-HCC中AAL反应性IgA1水平升高（图8G）。当IgG2[168-180]的聚焦位点占用保持不变时，IgG2在蛋白水平上表现出上调，导致IgG2[168–180]-N4H5F2升高，从而导致HBV-HCC中LCA-和AAL反应性IgG2水平升高。
图8:糖基化位点占有率。A已鉴定蛋白表达模式的火山图。B与HC相比，肝脏疾病(CHB、LC或HBV-HCC)患者中一致上调的蛋白列表。C HBV-HCC中协同上调蛋白的GO富集分析。D HC、CHB、LC和HBV-HCC中IgA1和IgG2肽的水平E HC、CHB、LC和HBV-HCC的平均糖基化位点占用率。F IgA1[127-153]、IgA1[332-353]和IgG2[168-180]的糖基化位点占用。G IgA1[127-153]、IgA1[332-353]和IgG2[168-180]的岩藻糖基化位点占有率。
本研究基于qULTRA多组学技术平台，全面表征了HC、CHB、LC和HBV-HCC的糖组学、糖蛋白组学和蛋白质组学特征，揭示了HBV-HCC进展中的潜在机制。研究结果表明，岩藻糖化水平的上调与HBV-HCC进展密切相关，并且IgA1和IgG2的岩藻糖化可能作为HCC的诊断标志物。
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Li, Z., Zhang, N., Dong, Z. et al. Integrating transcriptomics, glycomics and glycoproteomics to characterize hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma. Cell Commun Signal 22, 200 (2024). https://doi.org/10.1186/s12964-024-01569-y
